CRISPRi 简介
CRISPR-Cas9系统的简约和高效使其迅速成为生命科学实验室的新宠。近来，CRISPR-Cas9工具箱已经大大扩展，新增了CRISPRi和CRISPRa这两种工具。其中催化失活的Cas9（dCas9）在靶向启动子区域时会由于转录机制的空间位阻效应而导致基因表达的抑制。若将dCas9与阻遏结构域【如Krüppel-associated box (KRAB)】融合，则能实现高效的转录沉默。这个过程被称为CRISPRi（CRISPR干扰）。由于DNA没有任何变化，故CRISPRi实现了可逆的knockdown，而不是knockout。同理，与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域来激活基因表达，导致基因表达上调，这被称为CRISPRa（CRISPR激活）（图1）。
图1. dCas9介导的基因调控系统。(Cell. 2013 Jul 18; 154(2): 442–451)
CRISPRi与RNAi区别
看到CRISPRi功能描述是否心中存满疑问：与跌落神坛的RNAi有啥区别？与CRISPR有啥区别？
首先与RNAi相比：
- ①靶标不同：RNAi的靶标是RNA，而CRISPRi的靶标是DNA的转录起始位点(transcription start site, TSS)。
- ②作用细胞区域不同：一般情况下，RNAi在胞质内发生剪切，而CRISPRi在细胞核内。
- ③脱靶率不同：RNAi似乎更高一些，而CRISPRi复合物必须在转录起始位点附近才能发挥作用，因此降低了脱靶效应。
此外，在dCas9-KRAB融合蛋白前加一个条件性启动子可进行条件性CRISPRi。将若干sgRNA、启动子和dCas9-KRAB串联表达可同时进行多重基因的CRISPRi，实现多基因的同时沉默等优势（Zheng, Y., Shen, W., Zhang, J. et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nat Neurosci 21, 447–454 (2018). https://doi.org/10.1038/s41593-018-0077-5 ）。
CRISPRi与CRISPR区别
尽管CRISPR相关工具的基因敲除在基因功能研究和性状改良方面有重要的应用，但同时也存在其局限性。如某个基因功能的完全丧失会产生极端表型，而育种过程中通常想要的是中间表型。此外，CRISPRi可靶向lncRNA、microRNA、反向转录产物、细胞核内的转录本等，是研究非蛋白编码基因的有力工具（图2）。
尽管CRISPRi如此优秀，但目前也存在一些“小问题”，如靶基因的不完全沉默；PAM序列在一定程度上限制了结合靶序列的数量；染色体状态和修饰可能会影响dCas9-gRNA与DNA的结合；当靶基因的靶序列与其它基因重叠，或受双向启动子调节时，CRISPRi的调控可能会影响到周边的基因表达。
图2. 功能缺失或功能获得系统示意图。(ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416)
CRISPRi优化
近日，知名植物学期刊Nature Methods在线发表了多伦多大学和加拿大高等研究院（CIFAR）题为An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells的研究论文。通过优化KRAB domain来提高对靶基因的沉默效果，并筛选出目前基因沉默效果最具高效的ZIM3 KRAB–dCas9载体。
作者将57个人的KRAB结构域融合到dCas9的N端，并用慢病毒感染法检测它们被招募到两个不同的含报告基因结构中时的活性。其中一种方法是将dCas9-KRAB融合靶向到SV40启动子上的两个位点，该启动子驱动人类胚胎肾器官293T细胞（HEK293T）中绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。在另一组实验中，dCas9-KRAB融合蛋白靶向K562细胞的PGK1-EGFP报告基因下游的7×TetO阵列上（图3）。且两种报告细胞系均来自单细胞克隆，以确保报告基因和gRNA表达水平的一致性。
图3. KRAB结构域筛选系统。
在上述两种情况下，与nanolouc–dCas9对照组相比，不同的dCas9-KRAB融合体在被招募21天后对靶标基因表现出不同水平的沉默效果，从几乎完全沉默到无沉默，且在两个筛选系统间的结果基本一致（R2 = 0.59），这表明不同的KRAB结构域对靶标基因造成不同程度的沉默效果而与细胞类型无关。且ZIM3 KRAB结构域在两个筛选系统中表现出较强的基因沉默效果（图4）。
图4. 不同dCas9-KRAB融合体对靶标基因的沉默效果。
随后作者将ZIM3 KRAB–dCas9与现有的KOX1 KRAB–dCas9, KOX1 KRAB–MeCP2–dCas9和阴性对照Nanoluc–dCas9用慢病毒感染的方式靶标到HEK293T细胞的5个内源性启动子，并通过逆转录定量PCR (RT-qPCR)检测9d后的沉默效果。结果在4个启动子中，ZIM3 KRAB沉默效果显著优于KOX1 KRAB或KOX1 KRAB–MeCP2。此外，ZIM3-KRAB比其他两种结构更能抑制CD81的表达（图5）。
图5. 靶向ERK1，SEL1L和CD81启动子和相应基因的RT–qPCR表达水平。
综上所述，作者确定了一种高效的KRAB结构域，其具更有效的靶基因沉默和对gRNA选择较低的敏感性。除沉默效率外，相较于KOX1-KRAB-MeCP2结构，ZIM3-KRAB融合载体更小，可串联更多的gRNA，可用于多基因的大规模筛选。
