单细胞扩增之：LIANTI

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之前我们也了解过Single Cell 全基因组扩增过程，最近北大的谢老师又重新刷新了单细胞全基因组扩增的新高度：Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI),下面对本文做简单的解读?

转座子插入的线性扩增

Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)
Combines Tn5 transposition and T7 in vitro transcription for single-cell genomic analyses;

指数扩增 Vs 线性扩增

线性扩增优于指数扩增，基于以下两方面考虑：
指数和线性扩增

拷贝数

例如，上图中假设DNA片段A和B的扩增效率 (replication yields) 分别为100%和70%每一次，并假设原始A/B=1:1，最终的扩增系数 (amplification factor) 为片段A 大约10,000；
即在指数扩增 (上一次的扩增结果可以成为下一次扩增的模版) 时需要经过13次扩增过程 (213=8,192; 214=16,384)，此时B对应的最终产物量为1.713~=990，A/B~=8:1；
而线性扩增仅使用最初模版，扩增出的模版被分离出来不进入扩增过程，所以需要10,000次的扩增过程，此时B对应的最终产物量为0.710,000=7,000，A/B=1:0.7;
*当上述扩增用于研究拷贝数变异(CNV)时，指数扩增会引起致命性错误；

准确性fidelity

对于保真性达10-7的高保真聚合酶扩增一次人的基因组 (3X 109bp)理论上将随机性的引入大约300个碱基的错误，并且因为指数扩增特性这300个碱基错误的扩增产物将作为下一次扩增的模版，在300个碱基错误的基础上可能再次引入300个碱基的错误，而且上一次扩增的错误会延续在下一次扩增中，这样循环下去这种错误将会被无限次的扩大，这在检测SNVs时会产生假阳性。
相反，在线性扩增时，由于模版始终为最初的模版，所以这种扩增错误每次都会随机出现在不同的位置，很容易通过不同时期扩增产物间的比对而消除。

SNP Vs SNV

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） 和单核苷酸位点变异（single nucleotide variants, SNV）。个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的多态性。不同物种、个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、DNA序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每1000个核苷酸即可能出现1个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。在研究癌症基因组变异时，相对于正常组织，癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变（somatic mutation），称做SNV。

SNP (single nucleotide polymorphism) vs. SNV (single nucleotide variant) As their name suggests, both are concerned with aberrations at a single nucleotide. However, a SNP is when an aberration is expected at the position for any member in the species 鈥?for example, a well characterized allele. A SNV on the other hand is when there is a variation at a position that hasn鈥檛 been well characterized 鈥?for example, when it is only seen in one individual. It is really all a question of frequency of occurrence.

扩增过程原理

LIANTI

1.在LIANTI扩增时来自于单细胞的基因组DNA在Tn5转座酶的作用下转座LIANTI转座子 而随机片段化（400bp左右）。

  • LIANTI转座子 (LIANTI transposon)：包含一段19bp双链的转座酶结合位点和单链的T7启动子环；
  • LIANTI transposon DNA (5’/Phos/CTGTCTCTTATACACATCTGAACAGAATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’, IDT oligo with PAGE purification) ;
  • 等摩尔量的LIANTI 转座子和Tn5转座酶 (Tn5 transposase) 混合形成二聚体的LIANTI转座体 (LIANTI transposome).

LIANTI

2.碎片化后的基因组DNA被加上T7启动子标签，随后在体外转录线性扩增成成千上万的RNAs，紧接着3’端反向 and 合成互补的第二链形成双链LIANTI扩增用于DNA文库。

  • 来源于单细胞的基因组DNA被随机碎片化后被LIANTI转座子标记，随后DNA聚合酶作用于碎片DNA双链两端互补单链的环状T7启动子为双链的T7启动子；
  • 在T7RNA聚合酶的作用下体外转录线性扩增基因组DNA为基因组RNA，其中转录出的RNA能够在3‘ 端自动环化使单链状转座酶结合位点形成双链状；
  • 随后经历反转录作用，RNase消化和第二链的合成，双链的LIANTI扩增物标记上特异的分子条形码 (unique molecular barcodes) 代表原始单细胞基因组DNA 的扩增产物用于之后的DNA文库和高通量测序；

LIANTI扩增消除了非特异性priming和指数扩增相较于其他全基因组扩增方法，因此能够大大的降低扩增的偏好性和错误性。

相关疑问

1. 碎片化真的随机吗？

insertion-site
上图中黑色三角表示单细胞基因组插入碎片化位点，WebLogo表明其插入位点碱基不存在明显的保守性。

WebLogo说明：以下序列对应WebLogo图如下👇

1
2
3
4
5
6
7
> >1
> attcgtgatagctgtcgtaaag
> >2
> ttttgttacctgcctctaactt
> >3
> tgccgtgattatagacactttt
>

y axis解释the height of the y-axis is the maximum entropy for the given sequence type. (log2 4 = 2 bits for DNA/RNA, log2 20 = 4.3 bits for protein.)【WebLogo: A Sequence Logo Generator】

WebLogo

2. 碎片DNA大小？

Fragment-size

上图表明单细胞基因组被LIANTI转座体随机碎片化后平均碎片大小约为400bp。

3. 扩增效率？

对于单个包含~ 6 pg基因组DNA的人类细胞，体外转录扩增过夜可得到~20 ng的LIANTI扩增DNA，随后进行~30测序，并与其他扩增方法比较，发现：LIANTI扩增达到97%的全基因组覆盖度和17%的allele dropout rate。
outperforming

4. 扩增的一致性 (amplification uniformity) 如何？

上图表明LIANTI表现出较高的扩增一致性和较低的变异系数。

Lorenz curve：Perfectly uniform coverage leads to the diagonal line, and deviation from the diagonal line represents amplification bias.
变异系数coefficient of variation (CV)：标准差与平均数的比值，无量纲，用来反映数据离散程度的绝对值。

相关参考文献

  1. Simul-seq: combined DNA and RNA sequencing for whole-genome and transcriptome profiling
  2. Scalable whole-genome single-cell library preparation without preamplification
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