Single Cell全基因组扩增

单细胞测序得以实现或者测序质量的提升得益于whole-genome amplification (WGA),WGA方法存在较大的扩增偏好性(偏好性来源于序列本身GC含量和非线性扩增过程),导致低的基因组覆盖度;

全基因组扩增WGA

目前主要存在有三种扩增方法:
简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)、多重置换扩增反应(MDA)、置换预扩增和PCR扩增的组合(MALBAC)三种技术,各有优缺点。这些扩增方法可以把单细胞中pg级甚至fg级的DNA扩增至可满足测序的μg级样品量,正是这些技术的发明才使单细胞基因组测序成为可能。

DOP-PCR

Pure PCR-based amplification(DOP-PCR):基于PCR的WGA用随机引物进行指数扩增,这一过程对不同的扩增序列会产生较大的影响。

MDA


Isothermal amplification(MDA):利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火,接下来在高扩增效率和保真性的Phi29DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制,它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增,因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA。MDA虽然利用随机引物和链置换的ϕ29聚合酶在等温条件下扩增,相较于基于PCR的扩增能够降低序列本身GC含量造成的偏好性,对扩增覆盖度有较大提升,但依然是非线性的扩增,所以还是有较大的偏好性。

Φ29 :一种具有较高连续合成能力以及链置换的DNA聚合酶,它具有3’-5’外切酶(校正)活性。Φ29 DNA聚合酶不耐高温,65℃下放置10分钟方可使它失活。该酶对于模板有很强的模板结合能力,能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’—5’外切酶活性,可以保证扩增的高保真性。

MALBAC

Multiple annealing and looping-based amplification cycles(MALBAC):通过拟线性的预扩增来降低非线性扩增的偏好性。

MALBAC扩增原理

  • 首先,单细胞双链DNA在94℃变性成单链,随后在0℃时随机引物(包含有27个碱基的共有序列和8个变异碱基)均匀的结合到单链DNA模版上;
  • 65℃时链置换DNA聚合酶用来生成不同长度序列(0.5到1.5kb)的半扩增产物(semi-amplicon),随后在94℃变性成单链从模版上脱离。
  • 在随后的5个温度的循环中,对半扩增产物进行进一步的扩增来产生完整扩增产物(full-amplicons),且完整扩增产物的5’端和3’端互补。
  • 温度降到58℃进行完整扩增产物的环化,同时并防止进一步扩增和序列的杂交。
  • 半扩增产物和基因组DNA则继续循环来生成完整扩增产物。
  • 环化的完整扩增产物即完成拟线性的预扩增过程,随后进行PCR的指数扩增。在PCR扩增过程中与MALBAC引物27个共有序列相同的寡聚核苷酸作为引物。

  • 扩增巧妙之处

  • 只有以半扩增产物为模版才能产生两端互补的完整扩增产物,完成预扩增。
  • 扩增效果比较

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