CRISPR-sgRNA-Designer：从来都不应该那么神秘

CRISPR介绍和作用过程之前也学习总结过：CRISPR/Cas9。

Story

陆地棉基因组2015年完成测序，之后公布基因组信息，我所在实验也在从事CRISPR的工作，得益于技术革新和谢卡斌老师PNAS文章，CRISPR在棉花中的敲除首次在我们实验室获得成功，于是更多功能基因的CRISPR工作列入许多研究生的工作计划中，CRISPR编辑第一步就是目标基因的sgRNA设计。现有的绝大部分在线sgRNA设计主要是针对模式生物的，并不能用于非模式生物。但整个sgRNA设计原理是相通的也比较好理解：在目标基因序列的cds中匹配NGG的PAM区域，往前延伸20bp碱基就是一个理论的sgRNA位点，接下来所需考虑的就是这个sgRNA的特异性(不能编辑其他基因，20bp的碱基在几百M甚至G的基因组里面特异存在)和脱靶率(有时候为了保证特异性会允许一定数量的错配情况存在，这可能引起脱靶)，所以后续会对这样的理论sgRNA位点在全基因组内比对，寻找可能的编辑位点。对于perl和python来说实现这样的功能并不是什么难事，华农动科学院谢老师用perl编写的可自行提供基因组的sgRNAcas9程序开发出来。

sgRNAcas9流程

sgRNAcas9软件功能介绍如下：

软件优点是可自行提供基因组文件，缺点是对酶切位点的计算较为麻烦。
偶然也发现软件作者收录了我早期一篇总结╰(￣▽￣)╮

插播广告：该内容现有跟新，http://tiramisutes.github.io/2015/08/05/bio-online.html

软件下载

该软件是有perl程序编写，有windows和linux平台可供下载使用，根据相应平台自行下载：sgRNAcas9。

软件安装

修改可执行权限

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chmod +x sgRNAcas9_3.0.5.pl
chmod +x -R Seqmap
chmod +x -R Usefull_Script

文件准备

基因组文件：genome.fa
基因组cds文件：genome_cds.fa
基因组注释文件：genome.gff3 (非必须)
将上述文件mv到sgRNAcas9软件所在目录,用绝对路径会报错。

代码运行

1	perl sgRNAcas9_3.0.5.pl -i genome_cds.fa -x 20 -l 40 -m 60 -g genome.fa -o b -t s -v l -n 5

参数解释：
-i: 所需设计crispr敲除序列fa文件，可为多条序列；
-x: sgRNA长度，通常为20；
-l: GC含量下限；
-m: GC含量上限；GC含量一般为40%~60%。
-g: 基因组fa文件；
-o: 用DNA的哪条链作为crispr靶标位点搜寻，s正义链，a反义链，b双链；
-t: gRNA搜索模型，s单个gRNA，p一对gRNA搜寻；
-v: 操作系统类型，l为linux-64位，w为windows；
-n: 最大错配碱基数，一般为5。
-i参数设置全基因组cds的fa文件，-g参数设置去基因组fa文件就可得到上述提到的库文件。

结果解读

运行时间视所选物种基因组大小和目标基因多少相关；当基因组文件较大时windows下运行电脑易卡挂掉，最好在服务器下运行。
运行完后会生成report文件：sgRNAcas9.report_20.b.rhp.fa，包含以下内容：

注：OT为靶标去除NGG后的脱靶情况，即NGG前面20个碱基的脱靶；POT为种子序列的脱靶情况，种子序列即NGG前面的12个碱基；
sgRNAcas9_report.xls文件里有个综合了GC含量，错配和特异性后的风险等级排序，可简单选取Best对应crispr靶标位点。
Discard > High_risk > moderate_risk > low_risk > repeat_sites_or_bad ? > Best
当0M(on-/off-)值为0时意味着脱靶，大于1则存在有靶标序列，其他数字表示所存在靶标数目；